Процессы апоптоза и фрагментации ДНК спермиев человека после криоконсервирования.

В настоящее время все большее внимание  уделяется нарушениям отцовского генома, причиной которых может быть фрагментация ДНК сперматозоидов, включающая двухцепочечные и одноцепочечные разрывы молекулы ДНК.

Фрагментация ДНК сперматозоидов - относительно недавно открытая предположительная причина мужского бесплодия, которая интенсивно исследуется в последнее десятилетие [137,138]. В то же время известны противоречивые данные о возможном влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на ранние этапы эмбрионального развития, процесс бластуляции, на повышенный риск замирания беременности на раннем сроке и частоту спонтанных абортов [139-140.]. Фрагментация ДНК представляет собой двухцепочечные и одноцепочечные разрывы молекулы ДНК. Причинами разрывов ДНК считают процессы изменения структуры хроматина в ходе сперматогенеза и апоптоз  [  141-143.].

Разрывы ДНК, выявляемые в эякуляторных сперматозоидах, могут являться следствием дефекта созревания в ходе сперматогенеза. Около 20% эякуляторных сперматозоидов мужчин с различными параметрами спермограммы выявляются как апоптотические  [144].

Аномалии хроматина сперматозоидов часто ассоциированы с низкими показателями спермограммы, однако многие исследователи констатируют, что параметры фрагментации не имеют четкой корреляции с параметрами спермы, рекомендованными к исследованию ВОЗ [  145-146.]. Найдена отрицательная корреляция фрагментации ДНК с характеристиками спермограммы: концентрацией, подвижностью и процентом морфологически аномальных сперматозоидов [147.].

С целью проведения анализа фрагментации ДНК сперматозоидов был

использован метод SCD (sperm chromatin dispersion) (HaloSperm, Halotech, Испания). Метод основан на дисперсии хроматина вокруг ядра, за счет чего можно различить сперматозоиды с различной степенью фрагментации ДНК. Анализ был проведен с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus IX-71.

         Содержание сперматозоидов в эякуляте, содержащих фрагментированную ДНК, в норме не должно было превышать 20,0 % [148].

Обращает на себя внимание тот факт, что частота фрагментации ДНК в нативных спермиях при нормозооспермии составляет 7,5±3,02% и увеличивается  более, чем в два раза при олигоастенотератозооспермией (рис. 14).

Рис. 14. Фрагментация ДНК криоконсервированных спермиев. Halo Sperm Test. Х 400.

В то же время при таком тяжелом факторе бесплодия, как азооспермия уровень фрагментации ДНК в спермиях после биопсии составляет 6,2±1,3%. Аналогичную тенденцию отмечали после криоконсервирования спермиев из разных исследуемых групп. Так, при нормозооспермии и использовании эпидидимальных спермиев показатель фрагментации ДНК оставался на прежнем уровне, в группе с олигоастенозооспермией наблюдали увеличение индекса фрагментации ДНК (таблица 11).

Таблица 11.

Уровень фрагментации ДНК в нативных и криоконсервированных спермиях человека при нормо- и патоспермии

Этот факт нужно учитывать при планировании процедур вспомогательных репродуктивных технологий. Так, у мужчин с высоким уровнем фрагментации ДНК в эякуляторных спермиях можно рекомендовать процедуру биопсии с использованием эпидидимальных спермиев для оплодотворения ооцитов.

Непосредственно проблема функционального состояния спермиев после криоконсервирования касается эякулятов при патоспермии, поскольку в данном случае имеет место низкое восстановление клеток после отогрева и как следствие их слабая оплодотваряющая способность. Существующие методы выделения популяции поступательно-подвижных спермиев из суспензии криоконсервированных гамет не редко приводят к повреждению и потере большого числа спермиев, обладающих оплодотворяющей способностью. Криоконсервирование спермиев из эякулята с последующей технологией ЭКО является процедурой, которая используется в большинстве случаев при применении ВРТ. При патоспермии возможно также использование спермиев при капацитации - выделение активно-подвижной фракции спермиев и их добавление в среду культивирования с целью оценки переживаемости и жизнеспособности спермиев. Проведение детального изучения сотояния спермиев после криоконсервирования отогрева и последующего культивирования позволит повысить вероятность  прогнозирования их оплодотворяющей способности.

Подвижность спермиев при нормоспермии после криоконсервирования-отогрева  и последующего культивирования представлены на рис. 15. Полученные результаты показали, что инкубация спермиев в течение суток в среде культивирования приводит к снижению подвижности клеток относительно контрольной группы нативных спермиев. После криоконсервирования- отогрева в исследуемых образцах отмечалось снижение подвижности на 13,9% относительно нативных образцов. Следует отметить, что помещение криоконсервированных образцов в среду культивирования приводило к восстановлению исследуемого показателя.

s

Рис.15. Показатель подвижности спермиев при нормозооспермии, %.

Распределение клеток в квадрантах в контроле и в образцах спермиев после криоконсервирования – отогрева  и после культивирования in vitro при нормозооспермии приведены на рис.16.

Рис.16. Распределение спермиев при нормозооспермии, меченых АnnexinV/7AAD. Проточная цитофлуориметрия:

 а) нативные спермии;

б) спермии после криоконсервирования – отогрева;

в) спермии  после культивирования in vitro.

Данные о процентном соотношении некротических и апоптотических спермиев при нормозооспермии в условиях культивирования и криоконсервирования представлены в табл. 11. Полученные результаты показали, что инкубация спермиев в течение суток в среде культивирования приводит к снижению подвижности и количества жизнеспособных клеток относительно контрольной группы нативных спермиев. Данное изменение вероятно связано с инициацией процессов апоптоза (увеличение апоптотических клеток в 4,1 раза) и, как следствие повышением количества клеток в состоянии некроза (увеличение процента некротических клеток в 3,3 раза). Количество живых клеток достоверно не изменялось во всех исследуемых случаях, за исключением использования капацитации. при этом в равной степени увеличивалось количество апоптотических и некротических спермиев.

Таблица 11.

 Содержание некротических и апоптотических спермиев при нормозооспермии, % (n=5, M±m)