ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ КЛЕТОКГРАНУЛЕЗЫ И КУМУЛЮСА ЯИЧНИКОВ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ДОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ IN VITRO

М.П.Петрушко, Н.Н.Чуб, В.И.Пиняев, Е.Б. Ревенко

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков

В настоящее время проведение программы оплодотворения in vitro (IVF) в естественном (натуральном) цикле является самой важной и актуальной задачей в репродуктивной медицине, т.к. избегается мощное гормональное воздействие на организм женщины. При выполнении данной программы получают один–два ооцита на стадии метафазы II (M II) или метафазы I (М I) мейоза. Ооциты на стадии М Iимеют нечетко выраженную corona radiata, плотный скудный кумулюс и характеризуются отсутствием полярного тельца. Совершенно очевидно, что для данных гамет необходимы специальные условия дозревания.

Целью данного исследования являлось создание условий для дозревания незрелых ооцитов in vitro, с помощью введения в среду культивирования криоконсервированных клеток гранулезы и кумулюса.

Материалом исследования служили клетки гранулезы и кумулюса (КГК), полученные из преовуляторных фолликулов яичника человека у женщин, которые проходили программу IVF, с их информированного письменного согласия. После помещения ооцит-кумулюсного комплекса в условия культивирования, оставшиеся в фолликулярной жидкости КГК культивировали, криоконсервировали (Патент №46451, 2009, Украина) и хранили при - 196° С до использования. Мониторинг роста фолликулов, их аспирацию, этап культивирования гамет проводили по стандартной IVF-технологии  [Элдер К., 1990.]. После сокультивирования с криоконсервированными КГК незрелые яйцеклетки, достигшие стадии MII, инсеминировали методом единичного введения спермия в цитоплазму ооцита. Через 16-18 часов культивирования регистрировали оплодотворение при наличии, либо отсутствии женского и мужского пронуклеусов. Морфофункциональные характеристики эмбрионов оценивали на протяжении 128 часов культивирования.

Первую группу составили 30 ооцитов на стадии MI, которые культивировали в присутствии деконсервированных КГК в среде Meneso B2. Контролем служили 28 ооцитов, которые перед дозреванием освобождали от прилегающих клеток кумулюса с помощью раствора гиалуронидазы. Через 24 часа культивирования у 75±0,8% ооцитов первой группы и 44±0,5% ооцитов второй группы отмечали экструзию первого полярного тельца. Частота оплодотворения в первой группе составила 73,3±0,9%, во второй - 71,4±0,8%. Через 24 часа культивирования 81,8±0,7% эмбрионов первой и 60,0±0,5% эмбрионов второй группы находились на стадии 4-х бластомеров. Количество морфологически нормальных эмбрионов (без фрагментации с четкими ровными бластомерами, без вакуолизации и зернистости цитоплазмы) составило 75,0±0,4% и 75,0±0,5%, соответственно. Однако отмечается невысокая частота развития эмбрионов до стадии бластоцисты после дозревания ооцитов - 66,7±0,6% в первой и 50,0±0,5% во второй группе.

Таким образом, культивирование незрелых ооцитов в присутствие КГК приводит к более высокой частоте дозревания ооцитов до стадии MII, чем без данных клеток, что, возможно, связано с продуцированием КГК гормонов и факторов роста в среду культивирования и делает ее более енергоёмкой. Можно с уверенностью сказать, что частота дозревания ооцитов с КГК сопоставима с данными большинства работ по дозреванию незрелых ооцитов в условиях in vitro [Ben-Ami I. et al., 2011; Chian R.C. et al., 2001], однако, в группе ооцитов, с неудаленным кумулюсом, этот показатель достоверно выше, чем в группе с денудированным кумулюсом